采用组织分离法培育菌种要经过哪些步骤？

选用的子实体先经0.1%开汞水或70%酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。分离香菇时用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向 培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

蘑菇、香菇、平菇、金针菇、猴头菇、竹荪等栽培食用菌，以及松乳菇、松茸等纯化中的食用菌，均可采用组织分离法获得菌种。现以香菇为例说明组织分离法的主要步骤。

(1)选择种菇 按上述标准挑选种菇，采收后装入无菌纸袋内（忌用塑料袋）

(2)组织分离 在无菌条件下，先用酒精棉球对菇体进行表面消毒，然后手持菌柄，将香菇撕成两半，取手术刀经火焰灭菌、冷却后，在菌盖、菌柄交界处挑取一小块（米粒般大小）菌肉，移植到PDA斜面上(事先配制并灭菌备用)，即可转入培养观察阶段。

(3)培养观察 上述组织分离物在25℃条件下，经过3~5天即可看到分离物表面长出白色绒毛状菌丝，在培养基上呈星芒状生长。培养期间，应每隔1~2天检查一次，随时淘汰霉菌或细菌污染的培养物。培养10~15天后，再作1次转管培养，即可得到香菇母种。然后经栽培试验，确认其可以正常出菇后方可用于菌种生产和栽培。