食用菌菌种孢子分离技术？

1、种菇的选择和处理

优良的母种来自优良的种菇。收集孢子用的种菇必须发育纯正、健壮而无病虫害。种菇的成熟度也要适当，对于双孢蘑菇和草菇那样有菌膜的食用菌，最好选用菌膜将破而未破的，因为这样的种菇发育已成熟，而子实层又未污染，因此能很快散发出大量的无菌孢子。但是对香菇、侧耳那样没有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌，可以选取八成熟的、正在释放孢子的个体，因为刚从担子上弹射出来的孢子基本上也是无菌的。

种菇必须经过消毒，以清除沾染在它表面的杂菌孢子。对于子实层已外露的种菇只能用75%酒精在菌盖表面及菌柄部分进行揩擦消毒。

2、孢子采集方法

种菇经上述消毒处理后，就可以进行孢子的采集。采集孢子的方法常用的有以下几种：

（1） 种菇孢子弹射法 将消过毒的种菇插入孢子采集装置的支架上，支架上一般是用玻璃棒或粗铁丝折曲而成，类似点蚊香用的支架。在支架下放有培养皿底，作收集孢子用。外面用钟罩或大烧杯套住，整个装置都需先灭菌干燥，有关操作也必须在无菌操作室中进行，以保证所收集的孢子纯正。

（2）褶上涂抹法 大型的伞菌，褶片之间都有一定的距离，分离时应选择成熟的种菇，把接种针准确地插入褶片之间，轻轻地抹去褶片表面子实层尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。这种方法只要在操作时稍加注意，勿使接种针接触到长期暴露在空间的菌褶以外的部分，就不易感染杂菌，而获得无菌孢子。

（3）钩悬法 取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片，用无菌的不锈钢丝悬挂于培养瓶（一般使用三角瓶）内培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。将瓶置于该菌适宜的温度下培养，待成熟的孢子落在培养基上，立刻在无菌箱中移去菌褶或耳片，孢子继续在瓶中培养。

（4）贴附法 取一小片成熟的菌褶或耳片，用熔化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在试管斜面培养基正上方的试管壁上，经过6～12小时，待孢子落在斜面上，立刻把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中进行培养。这种方法所使用的分离材料和贴附剂，一般都不需要无菌处理。因为附着在湿的分离材料上的杂菌孢子在半天之内不会掉落，也未萌发，而分离材料上的孢子已自动弹射出来，只要及时转移到新培养基上，污染杂菌的机会是很少的。

3、孢子的分离

孢子从收集器上散落后应及早进行一次分离。当然孢子不经分离也可用于接种，成堆的孢子也能培养出纯的菌丝体来。但由于孢子不可能每颗都是发育健全的，因此孢子未经分离而接种培养出的菌丝体势必还包含有少数发育畸形的或生长衰弱的菌丝体。对于性基因属于四极性的食用菌来说，由于它只有四分之一的孢子间能配对，因此在这些菌丝体中也混有许多不孕的菌丝体。由此可见，采用多孢子来制备母种并不妥切，成堆的孢子只有经过分离选择以后才能确保所繁殖的菌丝体是优良的，能结实的。

孢子的分离一般都采用稀释培养法，即将成堆的孢子用无菌水进行适度稀释后，涂布在斜面培养基上，然后挑取其优良的菌落。在试管斜面上分离单菌落的方法，操作简便，杂菌感染力低。但单菌落分布不易均匀，挑菌也不方便。因此，有条件的可以取用平板来代替斜面。方法是先将培养基倒入无菌平皿内以制成平板，然后在平板上滴1～2滴孢子悬浮液，并立即用无菌玻棒推平，这样的平板经培育后，表面上就会出现多个均匀分布的单菌落，挑菌很方便。