如何进行细菌的分离培养及鉴定？

细菌分离培养与鉴定程序 一、 背景记录 1、猪的临床症状 2、不同猪的发病阶段早、中、晚、解剖前宰杀还是解剖前已死亡 3、解剖病变保存好照片 二、 分离用培养基 1、常用培养基鲜血琼脂培养基、巧克力培养基 2、非常用培养基麦康凯培养基、沙门氏菌选择性培养基 三、 病料的选取和保存 1、首选来自刚宰杀后的活畜禽或死后2-4小时内的畜禽 2、得到病料后应该立即进行细菌分离分离细菌前最长保存时间在4℃冰箱内最好不要超过3-4小时。分离细菌前应将病料保存在4℃冰箱不得放入-20℃冰箱。分离细菌后如需要根据细菌生长鉴定情况来决定病料用途需再次接种、需再次触片、需接种动物等等可先将病料暂存4℃冰箱但不得超过2天。一般情况下分离细菌后应及时将需长期保存的少量病料分装到塑料瓶中进行记录保存多余的病料进行无害化处理。 四、 分离路线 1、选择分离细菌的目标脏器 根据疑似疾病和病理变化确定一般选病变比较严重的脏器做为分离细菌的目标脏器并选择脏器的病健交界处做为细菌分离的最终部位。一头猪应该选择多个脏器或部位分离细菌。并对不同部位细菌在整个疾病中的作用有一定的评价如心血中的细菌多为全身感染分布的病原关节、肠道、创口、及肺脏则可能只是局部分布的细菌。 2、分离细菌 一般采用鲜血琼脂培养基划线培养、怀疑存在只能在巧克力培养基上且需要一定二氧化碳才能生长的细菌如副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌等感染时、应同时采用巧克力培养基划线、放到烛缸进行培养。 划线时应该在做到无菌操作的前提下尽量取较大的一块组织或较多量的分泌物、先在培养基表面涂布一小片区域然后弃去病料再用接种环从涂布区域开始进行划线。这样一方面可保证分离到病料中的细菌另一方面也能保证长出单个菌落为进一步鉴定提供方便同时也为评价病料中细菌含量及不同细菌数量比例的评价提供依据。 如果病料来自病程较长或死亡动物且细菌种类复杂、难以确定病原菌的情况下、可考虑分离细菌的同时取病料接种小鼠、再从小鼠分离细菌二者互为参考。 3、细菌的鉴定步骤 ① 生长特性及形态观察② 显微镜镜检③ PCR鉴定④ 测序鉴定 一种细菌的鉴定并不一定都得经过以上4步鉴定能确定细菌种类即可。 4、进行药物敏感性实验 5、细菌的保存 每一种细菌经鉴定后均应进行编号保存6管到-80℃冰箱保存2管到-20℃冰箱。并及时记录到细菌档案中鉴定清楚的菌种及时送交3-4管至余老师处。 6、细菌血清型的确定及致病性分析 有目的的选取分离到的细菌进行进一步实验。 五、 每月进行一次病案讨论 细菌鉴定人员需进行全面的总结报告总结报告内容包括病料接收时间、地点、临床背景资料免疫背景、流行情况、发病情况、死亡情况、畜主处理情况、效果病变图片、该病料相关该场的抗体检测结果、病原检测结果的实验室诊断结果、最后处理最后与畜主的联系及建议事宜。细菌鉴定人员报告完毕后再由大家进行讨论分析。同时细菌鉴定人员应整理好病案讨论记录。