草铵膦是以谷氨酰胺合成酶为靶标酶。谷氨酰胺合成酶是植物氮代谢过程中一种重要的解毒酶，可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性。
谷氨酰胺合成酶能与草铵膦在ATP参与下直接进行反应；在PPT处理后，PPT首先和ATP结合，磷酸化的PPT占据了谷氨酰胺合成酶的8个反应中心，从而抑制了谷氨酰胺合成酶的活性，造成植物体内氮代谢紊乱，氨过量积累，导致叶绿体解体，破坏光合作用，最终杀死植物。
草铵膦的这一作用机理，同样适用在昆虫和动物上，会产生神经中毒效应。特别是对一些肉食性昆虫的卵和蜕皮阶段幼虫有很强的毒性。
草铵膦在植物体内的传导转移较差。草铵膦在植物体内的传导主要有两种方式，一是通过木质部随蒸腾流向上传导，二是通过韧皮部向根部传导。其中，杂草对草铵膦的敏感程度与韧皮部的传导率有密切关系。不过，最好还是将草铵膦当触杀型除草剂看为好。